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实验技术交流

凝胶阻滞实验原理及步骤(精品教程)

文字:[大][中][小] 手机页面二维码 2019/10/9     浏览次数:    

凝胶阻滞(迁移)实验(EMSA,electrophoretic mobility shift assay),是一种研究蛋白与核算相互作用的技术。可用于验证转录因子与启动子相互作用的,也可用于蛋白-DNA、蛋白-RNA相互作用。今天我们就为大家介绍一下凝胶阻滞实验原理及步骤,跟着做,你也能一步一步完成凝胶阻滞实验。


实验原理

凝胶阻滞实验原理示意图


实验主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。根据实验设计特异性和非特异性探针,当核酸探针与样本蛋白混合孵育时,样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物;这种复合物由于分子量大,在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢,而没有结合蛋白的探针则较快;孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后,蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带,说明有蛋白与目标探针发送互作。


实验步骤

1.实验前准备

(1)合理的实验方案

根据研究目的合理设计特异性探针实验组以及非特异性探针对照组,如有必要还可以添加特异性抗体组、特异性核酸竞争组等。


(2)样本制备
可以选择提取样本的总蛋白、核蛋白或者使用纯化好的目的蛋白。对样本蛋白进行定量,实验中等量加入蛋白。


(3)探针制备
根据实验要求设计不同的探针并添加标记,可以合成核酸后自行添加,部分已知蛋白有商业化的抗体也可以直接购买。现在大多数实验室已经不再使用放射性标记,生物素使用相对较多。


2.形成蛋白-探针复合物

(1)在0.5ml离心管中按顺序将下列组份混匀:

蛋白样本(2-5μg)
Xμl

poly d(I-C)

1μl

Binding Buffer

2μl

Nuclease-Free ddH2O

Xμl
总体积 9μL


2)冰浴5min后,加入1μ探针。(对照组加1ul对照探针)

(3)PCR仪中室温(20-23℃)温育30min。


3.制备凝胶电泳

(1)制备6.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶:(注意根据试剂情况按比例调整总体积)

5X TBE

1ml

30% Acrylamide/Bis

2.2ml

deionized,sterilewater

6.62ml

80% Glycerol 80μl
10% AP 90μl
TEMED 10μl
总体积 10ml


(2)按标准步骤制备凝胶。

(3)加样前先在预冷的0.5X TBE buffer中120V预电泳10min,与电泳完毕后冲洗加样孔。


(4)混合样本及电泳缓冲液,点样电泳。

(5)将电泳槽置于冰上或者4℃环境中,恒压100V进行电泳,直至缓冲液指示带距离凝胶底部2~3cm为止。(大约50-60min,根据实际情况调整电泳时间及电压;电泳时间不宜过长)


4.转膜

(1)在预冷的0.5XTBE中浸泡凝胶,膜,滤纸和纤维垫。

(2)按如下顺序组装“三明治”:纤维垫,滤纸,凝胶,膜,滤纸,纤维垫。注意电极,确保凝胶位于阴极、膜位于阳极。

(3)在预冷的0.5XTBE中进行转膜。转膜装置应置于冰上或者低温室中,恒压60V转膜1h。(注意根据实际情况调整电压及时间)。

5.检测

(1)去除转好的膜,放入合适的盛有缓冲液的容器中,冲洗。(注意整个检测过程避免膜干燥)

(2)去掉冲洗缓冲液,加入封闭液后轻微震荡,室温封闭20min。

(3)加入适量的HRP酶标记的链霉亲和素(Streptavidin-HRP conjugate),室温震荡孵育45min。(勿将酶标记物直接加到膜上)

(4)去掉酶联物稀释液,用洗涤缓冲液洗膜三次,每次室温轻微震荡1 0min。

(5)配置反应底物,均匀加至膜上,室温孵育5min。(可以在加完底物后,用薄膜轻轻覆盖在膜上,是底物均匀覆盖,注意不要产生气泡)

(6)化学发光成像系统曝光成像(曝光时间的长短可以根据检测方法不同而进行相应调整)。


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