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实验技术交流

科学家发现新冠检测新方法比RT-QPCR还快,45分钟出结果

文字:[大][中][小] 手机页面二维码 2020/2/28     浏览次数:    

自2020年以来,新型冠病毒(2019-nCoV)一直威胁着人们的健康,尽管它和SARS相似,但无疑的是这种病毒的传染性更强。现有的RT-qPCR检测方法对人员和设备要求较高,因此迫切需要找到一种快速、简便的检测方法。

不久前,medRxiv分别发布了沈阳化工大学应用生物学研究所所长尹秀山博士团队和美国密歇根皇家橡树博蒙特Michael B Chancellor团队带来的报告,揭示了两种操作简单,且能再45分钟内出结果的新方法。据悉,这两种方法是通过逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)技术探索出的快速检测病毒新方法。
通过RT-LAMP可将环介导等温扩增(LAMP)和反转录结合,直接检测出RNA,通过与反应混合物中的pH指示剂耦合,检测人员就可以通过颜色的变化知道检测结果。



iLACO可检测出低至10个拷贝的ORF1ab基因


https://doi.org/10.1101/2020.02.20.20025874

https://doi.org/10.1101/2020.02.20.20025874


在这项研究中,研究人员通过制备合成ORF1ab基因序列的基因稀释液(从1,000,000到10份拷贝)等多个反应物,结果发现iLACO非常敏感,能够检测到低至10份拷贝的ORF1ab基因。为了扩大iLACO的检测能力,他们将新型核酸染料GeneFinderTM添加至反应混合物中,并在65℃温育一段时间后放在蓝光下,结果发现阳性组肉眼可见明显的绿色荧光,而阴性组则保持粉色不变。


阳性组和阴性组在蓝光下呈现不同颜色

阳性组和阴性组在蓝光下呈现不同颜色

那么iLACO对新冠病毒的检测能力如何?为此,研究人员评估了沈阳2020年以来经过RT-QPCR初诊的43个样本,结果发现97.6%(42/43)经qPT-PCR验证的样品与2 µl样本孵育40分钟后显示出一致的信号,只有一个样本在50分钟后颜色保持不变,表明低剂量病毒会导致假阴性或自发性阴性信号。

由于RT-qPCR检测大多使用5µl样品输入,为此研究人员特地增加了检测样本量以探究其是否有助于检测,然而结果却是和先前检测时不一致。研究人员推测这可能是RNA稀释缓冲液中存在Tris或EDTA导致的,因此可以通过调整缓冲液浓度来优化。


RT-LAMP 63°C下温育30分钟可获最佳扩增结果


而来自Michael B Chancellor团队的报告中,研究人员使用由COVID-19武汉-湖-1(Wuhan-Hu-1)完整基因组(MN908947)的核苷酸2941-3420设计的COVID-19 PCR标准,对几种引物、温度范围(57-65°C)和孵育时间(15-45分钟)进行了检测,确定了RT-LAMP的最佳条件。在63°C下温育30分钟可获得最佳扩增结果。

https://doi.org/10.1101/2020.02.19.20025155

https://doi.org/10.1101/2020.02.19.20025155

进一步,研究人员对COVID-19、MERS、BtCoV以及MHV病毒进行了系统特异性测试,结果显示该系统仅对COVID-19的样本有反应,使用人体血清、尿液、唾液、口咽拭子和鼻咽拭子均可成功地完成RT-LAMP。

从左至右分别为血清、尿液、唾液、鼻咽拭子、口咽拭子的检测结果

从左至右分别为血清、尿液、唾液、鼻咽拭子、口咽拭子的检测结果

此外,研究人员还将RT-LAMP引物的序列与SARS和与感冒相关的冠状病毒的序列进行了比对,结果发现这些冠状病毒与RT-LAMP引物存在27-54%的核苷酸不匹配,这表明它们不可能检测出RT-LAMP阳性结果。考虑到病毒可能发生突变,研究人员还检查了RT-LAMP引物是否与来自其他地点的27个不同COVID-19分离株存在不匹配现象,结果发现不匹配度为0。

尽管这项研究存在一些局限,比如COVID-19是生物安全级别,由于无法直接检测相关病毒而使用了来自这些病毒相同区域的核苷酸寡核苷酸,但是这些实验确实证明了该方法的可行性以及对COVID-19的特异性,对于潜在感染者的筛查和病毒检测具有很大的价值。
这两项研究旨在寻找到比RT-qPCR检测更加快速、准确且简单易上手的病毒检测方法,这些方法对于社区和普通人群检测是否感染病毒具有重要意义。

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