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实验技术交流

流式细胞技术:浅谈流式细胞实验

文字:[大][中][小] 手机页面二维码 2019/12/27     浏览次数:    

流式细胞技术是一项广为使用、基于激光的生物学技术,利用流式细胞仪对处于快速流动的荧光染色的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选,是当代最先进的细胞定量分析技术之一。主要有以下几个特点:

1.只要样本制成单个细胞或生物颗粒悬液均可以分析。
2.测量速度快,每秒钟可以测量数千个乃至数万个细胞
3.同时测量每个细胞的多参数特征。
4.在进行细胞特征分析的同时可以把指定特征细胞分离出来(分选技术)

关于流式细胞仪

流式细胞仪由三部分构成——
1.液流系统,包括流动室和液流驱动系统;
2.光学系统,包括激发光源和光束收集系统;
3.电子系统,包括光电转换器和数据处理系统。


流式细胞仪工作原理
流式细胞仪的工作原理是使悬浮在液体中分散的经荧光标记的细胞或微粒逐个通过样品池,同时由荧光探测器捕获荧光信号并转换成分别代表前向散射角、侧向散射角和不同荧光强度的电脉冲信号,经计算机处理形成相应的点图,直方图和加三维结构图像进行分析。
目前临床中运用流式细胞仪进行外周血白细胞、骨髓细胞以及肿瘤细胞等的检测,是临床检测的重要组成部分。

流式细胞仪的工作原理


流式细胞术基本原则
1.使各种液体和悬浮细胞样本新鲜,尽快完成样本制备和检测;
2.针对不同的细胞样本进行适当洗涤、酶消化或EDTA处理,以清除杂质,使粘附的细胞彼此分离而形成单细胞状态;
3.对新鲜实体瘤组织可选用或联用酶消化法,机械打散法和化学分散法来获得足够数量的单细胞悬液;
4.对石蜡包埋组织应先切成若干40-50um厚的蜡片,经二甲苯脱蜡到水后,再用前述方法制备单细胞悬液;
5.单细胞悬液的细胞数不应少于10000个。


实验步骤

1.首先,制备单细胞悬液
将待测细胞或微粒制成单细胞悬液,经特异性荧光染料标记抗体进行染色。在恒定气体的压力下进入流动室,不含细胞或微粒的缓冲液在高压下从鞘液管喷出。鞘液管入口方向与待测样品流形成一定角度,鞘液包绕着样品高速流动,组成一个圆柱形的液流束。待测细胞或微粒在鞘液的包被下单行排列,依次通过检测区域。

2.其次,收集单细胞上的荧光信号
流式细胞仪通常以激光作为发光源,经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上,细胞或微粒上的荧光染料被激发,产生散射光和激发荧光。光散射信号在前向小角度进行检测,这种信号基本上反映了细胞体积的大小;荧光信号的接受方向与激光束垂直,经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离,形成多个不同波长的荧光信号。

3.再次,统计结果
荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原强度或细胞内物质的浓度,经光电转换变为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理,将分析结果显示在计算机上。

4.最后,做细胞分选
细胞的分选是指根据所测定的各个参数将指定的细胞从细胞群体中分离出来的一种方式,通过分离含有单细胞的液滴实现。在流动室的喷口上方配有一个超高频的压电晶体,产生的振动使喷出的液流形成均匀的液滴,待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷,当液滴流经带有几千伏特的偏转板时,在高压电场的作用下偏转,落入各自的收集容器中,不予充电的液滴落入中间的废液容器,从而实现细胞的分离。


流式细胞技术的应用

1.其测定细胞内DNA的变异系数最小,一般在2%以下;
2.能准确地进行DNA倍体分析;
3.借助于荧光染料进行细胞内蛋白质和核酸的定量研究;
4.快速进行细胞分选和细胞收集;
5.医学应用:免疫功能研究各种干细胞的检测,癌症病人的多药耐药性,细胞功能及代谢动力学研究,血小板分析(心血管疾病),流式细胞术与分子生物学研究;
6.应用于外周血内皮细胞测定、调节性T细胞等尖端领域。


流式细胞仪的应用

(一)、检测细胞凋亡
1.亚G1峰检测:凋亡细胞双链DNA发生裂解导致染色质浓集。DNA降解后,形成长度为180-200bp的DNA片段,成为凋亡小体。在流式细胞检测上出现亚二倍体(G1)峰值。而常规坏死的DNA分解是随机的,DNA片段大小不一,在流式细胞检测上可出现比亚二倍体(G1)峰更小的细胞碎片峰。


2.Annexin V/PI双染色法:当细胞发生凋亡时,PS(磷酯酰丝氨酸)从细胞膜内转移到细胞膜外,使PS暴露在细胞膜表面,Annexin V具有易于结合PS的磷脂结合蛋白。因此,建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指标并结合一种染料排出试验已检测细胞膜的完整性的检测方法。该法使用FITC标记AnnexinV,同时结合使用PI标记细胞核。

3.JC-1染色法检测线粒体膜电位:JC-1有单体和多聚体两种存在状态。低浓度时,以单体存在,可检测到绿色荧。,用流式检测时,通常为FL-1通道。高浓度时,以多聚体存在,可检测到红光,流式检测通常为FL-2通道。细胞膜电位正常时,JC-1通过线粒体膜极性进入线粒体内,并因浓度升高而形成发射红色荧光的多聚体。而凋亡细胞,线粒体跨膜电位去极化,JC-1从线粒体内释放,浓度降低,逆转为发射绿色荧光的单体形式。故而可以通过检测绿色和红色荧光检测线粒体膜电位的变化。


(二)分析细胞周期

(三)在免疫学中的应用——淋巴细胞免疫表型分析
经常测定的淋巴细胞免疫标记包括:
T淋巴细胞:CD3、CD4、CD8          
B淋巴细胞:CD19或CD20
T抑制细胞:CD3+CD8+                   
NK细胞:CD56、CD16
T辅助细胞:CD3+CD4+
活化细胞:CD25、HLA-DR、CD40L、CD71

流式细胞仪

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