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实验技术交流

qPCR数据统计分析工具

文字:[大][中][小] 手机页面二维码 2019/12/26     浏览次数:    

辛辛苦苦做好了qPCR实验,可是拿到了一堆Cq值,对于不擅长统计分析的小伙伴们来说,简直欲哭无泪。不过不用担心,我们有它:short for Statistical Analysis Tool for Quantitative PCR Data,简称SATQPCR。

它是免费的网页版工具,无需安装软件,简单易用;完全遵循 MIQE 指南设计2(扩增效率、内参基因的选择等);支持图片生成、t 检验和方差分析(事后检验采用 Tukey Test)。地址:http://satqpcr.sophia.inra.fr/cgi/home.cgi

话不多说,我们直接来上干货。


使用教程

1.比如要研究处理后小鼠的三个靶标基因(Gene1、Gene2、Gene3)随时间(0h、2h、4h)的表达水平变化,有三个基因(Ref1、Ref2、Ref3)作为参照基因。
设置 Control 组(col)和处理组(M),有两个技术学重复(Sample Name 完全相同)和三个生物学重复(即 Sample Name 的后缀,小鼠 1、2 和 3)。
按照下图所示导出 Cq 值到 Excel 或者 txt,其中第二行为扩增效率,没有数值用 NA 表示。



2.进入 SATQPCR 网页,点击「SATQPCR Tool」按钮即可到达数据上传页面。点击「选择文件」按钮将 example 数据文件上传。



3.如果要做 ANOVA 分析,则需要选择 Yes 选项,同时上传 Factor 文件。
该文件含有变量的数量等信息,如下图所示,该实验包含处理因素和时间两个考察维度,处理因素有两个变量(处理 M 和不处理 col),时间有三个变量。上传后点击 upload。


4.数据上传成功后会自动识别重复的数量。
内参基因可以由用户自己指定(fixed)或者由程序根据算法3自动寻找最稳定表达的基因(calculated),数量可以选择 2 个或者 3 个。
同时可以选择以某一个样本(如 col0h1)为 control 来建图,误差线可选择标准误 SE 或者标准差 SD。点击 Submit 提交。



5.数据文件中包括表达量数据、柱状图和统计检验三部分,可以直接点击下载压缩的结果文件。



6.Normalize_Data 文件中包含每个靶标基因的均一化表达量。
Gene_柱状图展示了不同的 sample 中特定靶标的表达量(以 col0h1 为 control),Sample_柱状图展示了同一 sample 中不同靶标的表达量。


7.Sign.test 文件展示了特定靶标在不同样本中表达量的 t-test 检验的 p 值矩阵,下图以 Gene1 为例,可以看到 col0h1 样本与其他样本均有极显著的统计学差异(p<0.01)。



8.summaryANOVA 及 summaryANOVA2 分别展示了单因素和双因素的 ANOVA 检验结果。
该实验中我们需要参考双因素的检验结果,可以看到 Treatment 因素具有极显著的统计学差异(双星号表示,最后一行有标注说明),这样需要对 Treatment 因素进行 Tukey Test。


9. tukeyTEST 给出了不同基因的检验结果,包括差值(diff)、95% family-wise 置信区间(lwr 和 upr)及 p 值。


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