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实验技术交流

浅谈Western Blot实验问题

文字:[大][中][小] 手机页面二维码 2019/12/13     浏览次数:    

在做Western blot时候,你可能有过这样的经历,膜不是一片黑就是一片白,明明目的条带只有一个,可是每次跑蛋白都能跑出好几条,有的离目的条带比较远相对好认,但有的离目的条带特别近,如果正好此处没有marker就更难认了,这里给小伙伴们盘点下这些Western Blot问题究竟是什么原因造成的,方便大家找出自己的目的蛋白。


目的条带好多个
1.抗体特异性不够
这里注意查看抗体说明书,有的抗体可以识别同源性的蛋白,如果你的目的条带只有其中一条,可以查看两种蛋白相对分子量的大小从而确定位置,比如下面这两个蛋白,1的分子量是76,2的分子量是82,从而可以确定上面的是2下面的是1。


另外一种情况是识别磷酸化的蛋白的,为了更精准地确定目的蛋白的位置,可以再孵一下总蛋白。以GSK3β蛋白举例:

先看看抗体:

再看应用部分就可知这个抗体既可以识别GSK3α在Tyr279的磷酸化,也能识别GSK3β在Tyr216位的磷酸化,抗体孵育结果如下,出来多条:

为了确定目的蛋白,洗去抗体再孵总蛋白GSK3β,结果如下,从而可以确定pGSK3β Tyr216的目的条带是位于下面的那条。


2.同种蛋白
一种蛋白经过酶的剪切之后,抗体既能识别剪切前的也能识别剪切后的,但是这里需要注意了,虽然孵出了两个蛋白,但这两种目的蛋白的曝光条件可能不一样,笔者所做的两个蛋白,2min短曝显示的是酶剪切前的蛋白,剪切后的蛋白曝光条件为10min长曝。


3.二聚体/三聚体
如果你的目的蛋白分子量是80kd左右,跑出来的一张膜上在150、200kd分子量的marker附近位置处也显示有条带,那么可能的原因就是蛋白发生了二聚体/三聚体化。

4.前期(裂解、提取、煮蛋白等)操作不当导致蛋白降解或部分降解
裂解时没有加入足够的蛋白酶或磷酸酶抑制剂、裂解后没有及时放在冰上,长时间暴露于室温下、煮蛋白不充分等等都可以导致蛋白降解,很典型的一个现象就是电泳、转膜条件等都无误的情况下膜上出现数条条带且无法分辨目的蛋白,连内参也是这样子,就只能重新提蛋白再做了。以下图为例,可能的原因是蛋白降解了一部分,未降解部分仍然可以和抗体结合就导致了多条带的发生。

如果内参条带十分好看,就只有目的蛋白出现这种情况,在排除抗体的原因后可能是裂解液出现了问题,可尝试着更换裂解液。


5.目的蛋白就是这么多条带
不要总怀疑自己,跑出了好多条带,自己也懵了,没关系,可能目的蛋白就是这么多,如果少了反而不正确了,给大家看一个例子:


6.是目的蛋白,但位置稍有变动
举个栗子,过表达一个蛋白,这个外源性的蛋白带有荧光基团或Flag,因为有了这些的“重量”,目的条带出来时会比内源性表达的位置稍微靠上。


我们再来说说有marker但膜一片黑的情况

1.抗体原因
一抗、二抗都有可能,如果使用同样的二抗别的蛋白可以出来那就是一抗的锅了,看看你的抗体是否已经过期失效了,保存抗体的条件是否适合,购买渠道是否值得可信。这里给大家提个醒,笔者在实验室一抗都是回收用的,注意回收的也不能一直用,用几次就要换新抗体。

2.洗膜
洗膜时间不够,出现一片黑的情况时可以尝试延长洗膜时间,当然了,这里也要注意洗膜液是否新鲜未变质,如果洗膜液出现问题,蛋白也是要受到影响的。

3.PVDF膜
PVDF膜大概是我们特别容易忽略的一个关键因素。但是笔者遇到过,之前实验室买的便宜的膜不管孵什么蛋白背景都是黑黑的,后来查了很久才知道是PVDF膜的原因。(便宜的货慎用)

4.蛋白样品

膜上一片白
1.连marker也没有,最有可能的原因就是蛋白根本没转上,警告大家千万别把转膜的插头插反,红对红黑对黑,这是笔者血泪的教训。还有可能插头正负极正确,但是转膜时间过短。
2.有marker,看看抗体有没有孵对,是不是剪膜的时候把目的条带剪去了,抗体有没有失效,二抗的种属对不对,再去确认抗体孵育的时间和条件。

膜上有蛋白的影子但是没有条带
1.还是抗体原因;
2.蛋白本身表达量很少,可尝试增加蛋白样品的浓度或上样量;
3.转膜时有气泡;
4.蛋白前期降解,如果是磷酸化的看看裂解时有没有加入足够的磷酸酶抑制剂;
5.以上需要对比内参来分析。
6.转膜条件不合适,或者使用的膜孔径大小不合适。分子量比较小的蛋白一般选择孔径较小的膜。
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