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实验技术交流

要做好qPCR、RT-PCR实验我们需要注意什么?

文字:[大][中][小] 手机页面二维码 2019/11/20     浏览次数:    

对于qPCR和RT-PCR实验,很多实验汪可能并不陌生。不过想要得到漂亮的曲线和数据结果图我们还应该注意一些细节。今天就给大家分享一下做qPCR和RT-PCR实验的一些经验和心得。


RT-PCR部分:

对于RT-PCR来说,它不仅仅只是逆转RNA,更对后续qPCR或其他实验的结果有着至关重要的作用,我们需要注意以下几点:

1.提取RNA后并检测其质量

对RNA质量的检测包含RNA完整度测定及RNA产量测定两部分:
(1)RNA的完整度对cDNA的合成结果会产生重要的影响。
通过琼脂糖凝胶电泳进行检测是方法之一,这也是一般实验室最常用的方法,通常完整的真核 RNA 应包括 28S 和 18S RNA 条带,且较大的条带的强度应是较小条带的两倍左右(两个条带强度大致相同也是可以的)。
另一种方法是使用仪器进行检测(Agilent BioAnalzyer),通过 RIN 值的高低反应 RNA 不同的完整度,当 RIN 为 8-10 时,表示 RNA 质量非常好;当 RIN 值低于 7 时,则说明 RNA 有降解,可能会导致一些罕见信息的丢失等问题,但这种方法成本较高,主要是应用在建库实验中,一般实验室里并没有这种仪器。
(2)同时对 RNA 产量的准确评估也很重要,保证后续实验的进行。
我们可以选用 Nanodrop 仪器进行检测,该仪器使用非常方便,不需要对样品进行稀释,并且具有非常宽的 RNA 测量范围。
根据我们实验室的经验,它可以准确读取 5-10ng / μl!
还有一些同学会使用传统紫外分光光度法或者梯度点样用琼脂糖凝胶电泳进行粗略检测,但这两种方法不仅准确度较低,而且紫外分光光度法对样本的消耗也较大,并不是很推荐。

2.去除基因组 DNA 的污染很重要

RNA 中存在的基因组 DNA(gDNA)污染可能是最终 PCR 反应中假阳性结果出现的原因。
一方面我们可以通过设计跨内含子的引物去除 gDNA 的影响,但对于没有内含子的基因,这种方法可能就行不通了。  
这时,通过 DNAase 对提取的 RNA 进行预处理成为唯一的方法。


3.选取合适的RT Primer是关键

通常 RT primer 可分为三类:oligo dT,随机引物以及基因特异性引物。
根据不同的实验需求需要选择适合的引物进行使用。
oligo dT 可以获得真核生物 mRNA 全长;而 mRNA 长度过长,或者没有 polyA 尾(原核 mRNA 或 rRNA),就需要考虑使用随机引物进行 RNA 的反转录,随机引物虽能确保长基因的 5' 末端的转录,但并不能获得整个基因全长的 cDNAs,且对 RNA 的质量要求比较高;对于扩增真核生物的 total RNA 来说,这时随机引物和 Oligo-dT 引物的混合物似乎能给出一个令人满意的结果。
剩下的一个选择就是基因特异性引物,用此类引物仅产生所需要的 cDNA,适用于目的序列已知的情况。


4.如何应对复杂的RNA二级结构

如果要获取全长 cDNA,那么 RNA 二级结构的问题就无可避免,一般的逆转录酶在遇到此类结构后,容易停止反应或从模板上脱落下来。
要想判断模板 RNA 是否具有二级结构还比较困难,但如果基因中 GC 含量较高,这通常意味着 RNA 很难被变性且结构较为复杂,此时需要 65℃,5 min 对其进行充分变性,打开复杂结构以避免其对实验结果的影响。


qPCR部分:

一般做完逆转录,后续就到了qPCR的部分,其实它和PCR差不多,只是qPCR过程中每个循环都有数据的实时记录,因此可以对起始模板数量进行精确的分析。

对于qPCR来说,有以下几点经验和大家分享:


1.加样需要仔细,勿加错

大家可能有过这样的经历,好不容易做完逆转录,结果加样的时候由于各种原因还是出现了加错样的事件。


2.引物设计时,应遵循适当的原则

在使用 SYBR 染料法时,引物设计需遵循以下原则:引物长度 18~25bp,产物长度 80~300bp,GC 含量 40~60%,避免引物内含有互补序列,3' 端尽量不要出现含有连续三个以上的 G 或 C 的片段,真核基因设计引物时最好跨内含子哦。


3.选择合适ROX参照染料

一定要选择适合自己实验室仪器对应的ROX

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