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实验技术交流

体外诊断中的核酸提取纯化

文字:[大][中][小] 手机页面二维码 2019/11/19     浏览次数:    

体外诊断是指利用人体血液、体液、组织等样本,进行检测,从而得到诊断信息并对疾病或身体机能进行判定的服务或产品。想要对人体样本进行检测其中的一项关键工作是需要对样本核酸进行纯化,而核酸纯化方法是影响所提取核酸质量的重要因素。因此,得到高质量的核酸尤为关键!下面为大家列举了几种体外诊断中核酸的纯化方法:


1.速率曲带离心法

在此法中,密度梯度液顶部的狭窄样品区带被分层,从而避免不同沉降速率的颗粒之间交叉污染问题,(见图1)。然而,由于上样区带狭窄,因此限制了可容纳在密度梯度液之上的样品量(通常为10%)。

梯度液可以稳定区带,并且可以增加密度和粘度。当区带中的颗粒向下移动通过密度介质时,移动速度较快的颗粒就会先于移动较慢的颗粒,从而形成含有类似大小颗粒的各个区带。
此法的缺点是:

① 离心时间较长
② 需要制备惰性梯度介质溶液
③ 操作严格,不易掌握


2.苯酚- 氯仿萃取

苯酚和氯仿均为有机溶剂,其萃取核酸原理是苯酚与氯仿对于与核酸结合的蛋白质有极强的变性作用,但对核酸本身没有影响。经离心后,形成上层水相下层酚/氯仿相,变性后的蛋白质溶于酚/氯仿相或者在两相交界处形成凝胶层,而核酸易溶于水而不溶于有机溶剂从而留在水相;同时,氯仿可以有助于有机相与水相的分离和去除溶于水的部分酚。最后,再将核酸通过乙醇沉淀即可达到提取的目的。
此法的缺点是:

① 蛋白质难以彻底去除
② 操作难度大且费时
③ 使用危险化学品


3.离心柱纯化

此种方法是利用核酸表面会覆盖一层由水分子构成的薄膜,在高盐环境下,这层亲水膜会遭到破坏从而核酸可被吸附在离心柱上,而其他杂质如蛋白质、代谢产物等则会被离心沉淀与核酸分离。最后通过洗脱,将核酸从吸附膜上脱离,即可得到纯化后的核酸。离心柱纯化也是的试剂盒提取中广泛的使用方法。

此法缺点如下:

① 高度依赖吸附膜的结合能力
② 洗脱不完全导致核酸流失
③ 无法大量提取核酸


离心柱纯化法示意图


4.磁分离法

携带正电荷的磁珠易于吸附负电荷的核酸,主要用于从人血清或血浆样品中提取DNA 和RNA(例如从血液样本中检测HIV 或HBV 病毒基因组的样品制备)。一般而言,将样品与结合缓冲液和磁珠混合,核酸与磁珠结合后,经过数次洗涤与磁场捕获,洗脱下来的核酸即可通过PCR 或其它特定方法来检测特定的DNA 或RNA。磁分离法也是广泛应用于诊断行业,且能实现高通量、自动化的核酸提取方法。

磁珠法核酸提取流程示意图


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