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实验技术交流

浅谈一些qPCR问题及解决方案

文字:[大][中][小] 手机页面二维码 2019/11/15     浏览次数:    

今天主要和大家分享一些qPCR问题的解决方法,可能其中有些以前说过,但不尽相同。

1.重复性很差

造成qPCR实验重复性差的原因有以下几点:

① 移液枪不准,加样不准确

这种情况下,我们可以更换性能更好的移液枪,扩大反应体积,将模板做高倍稀释,以大体积加入反应体系中

② 定量PCR仪在不同位置温度不一样

这个需要定期校准定量PCR仪

③ qPCR预混液未混合均匀

使用前应充分混匀qPCR预混液

注:重复性较为理想的扩增曲线STD<0.2


2.熔解曲线为非单一峰

这个可能的原因有以下几点:

① 非特异性扩增

可以根据设计原则设计新的引物,可通过梯度 PCR 对引物退火温度进行优化

② 出现引物二聚体,引物为非特异性引物

引物设计不合理导致的引物二聚体在熔解曲线内峰值一般位于75℃左右,如该峰显著请按照以下方面进行优化:
(A)优化扩增条件,可设置梯度Tm,摸索最佳的Tm值
(B)引物浓度太高,适当降低引物浓度
(C)可通过琼脂糖凝胶电泳确认引物二聚体

③ 模板有基因组污染

重新制备cDNA模板即可


3.Ct值出现过晚

① PCR产物太长

PCR产物不宜太长,一般100-50bp即可

② cDNA模板降解

重新制备模板,重复实验

③ 扩增效率极低

优化反应条件,尝试三步法扩增程序,或者重新设计引物

④ 反应体系中存在PCR反应抑制剂

加大模板稀释倍数或者重新制备模板重复实验

⑤ cDNA模板浓度低

减少稀释度重复实验


4.内参基因Ct值正常,目的基因Ct值出现较晚

内参基因Ct值正常,说明试剂及操作步骤无误。目的基因Ct值出现较晚,可能原因为:

① 目的基因表达量偏低--重新富集RNA
② 目的基因引物扩增效率低:
将模板进行梯度稀释,以确定引物的扩增效率
降低退火温度
重新设计引物

5.扩增曲线异常,如“S”型曲线

1)反应体系引起的扩增曲线不光滑---扩增效率偏差(过高或过低)
A. 扩增效率过高

出现非特异扩增或引物二聚体:反应体系内模板浓度太高以及模板核酸质量较差可能导致出现抑制PCR反应的现象。在绝对定量时表现扩增效率大于110%。
解决方案:
① 去除模板浓度最高的反应孔并重新分析标准曲线。如果效率重新回到110%以下,则分析良好;
② 对目的基因做标准曲线,一般用克隆该基因的质粒做梯度稀释,或用PCR 产物做梯度稀释,然后做定量扩增,通过曲线评估反应效率。绝对定量有效的扩增效率在90%-110%;
③ 重新纯化模板,去除模板中存在的潜在抑制物。切记应延长干燥时间,以去除乙醇沉淀过程中的乙醇,或采用另外的纯化柱加入洗涤液将离液盐从硅胶纯化物中去除。
B. 扩增效率过低

主要表现在试剂浓度不适(主要是引物、镁离子和Taq DNA聚合酶),尤其是在多重实验中,引物对Tm差异超过5°C 以及热循环条件不合适的情况下,试管中各种同源物质的竞争作用可造成反应效率低下。绝对定量表现:扩增效率<90%。
解决方案:对上述因素逐一排除后进行调整优化实验体系。
C. 个别扩增曲线异常
如个别扩增曲线突然骤降:反应管内留有气泡,由于温度升高后气泡破裂,使仪器检测到的荧光值突然降低所致。
解决方案:进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。
2)仪器设置不当引起的曲线异常
基线设置不当,如扩增曲线断裂或下滑(基线的终点值大于Ct 值)。减小基线终点(Ct 值- 4),重新分析数据;
A.基线范围和阈值设置不当
基线范围和阈值都是人为设定的参数。二者一般由仪器自动默认为合适值。在对同一程序中的多种试剂盒或化学剂进行评估时,经常出现阈值设置不当造成不同组别数据的扩增曲线差异:软件自动选择的阈值更适合平台更高的曲线,这将导致数据组中的Ct值出现偏差,因为其最佳阈值比此值更低。因此,需对每个数据组进行独立研究,这样才能根据具体情形选择最佳阈值;
B.Rox 添加不当
表现为扩增曲线呈锯齿状且不连续,需校正参比染料。


6.绝对定量时标准曲线线性关系不佳

① 加样误差

加大模板稀释倍数,提高加样体积

② 标准品降解

重新制备标准品,重复实验

③ 模板浓度太高

增加模板稀释倍数


7.绝对定量中通过以下参数对qPCR结果加以判定

A.相关系数(R2):>0.98,越接近1,结果可信度越高。R>0.99 或R2>0.98;
B.标准曲线斜率:-3— -3.5,100%扩增效率对应的斜率是-3.32;
C. PCR 扩增效率(E):90%-110%,越接近1,越理想。其对应的斜率为-3.58 至-3.10。效率= 10(-1/斜率)-1;
D.检测灵敏度确认:35Cycles 内可得到好的定量结果,如果采用SYBR 检测方法,30cycles 内无非特异性产物扩增;
E. NO template control (NTC)确认:35cycles 内无引物二聚体产生;
F. 重复性:STD<0.2。

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