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实验技术交流

qPCR结果每次都不一样?这些技巧你需要掌握!

文字:[大][中][小] 手机页面二维码 2019/9/16     浏览次数:    

做过qPCR(荧光定量PCR)的小伙伴,可能会遇到这样的问题,明明已经按照文献的方法,照搬PCR引物,可还是每次结果都不一样。

其实原因有这么几个:


1.操作原因,你可能不太会用移液枪

有些小伙伴可能会说,移液枪使用多么简单,怎么可能不会用?实际上,在使用移液枪,特别是微量移液枪的时候,我们往往会长期快速操作,也就是说在弹簧还没来得及恢复的时候,我们已经又按了一下了。这样可能导致的结果不用我多说,首先可能会导致……指关节受伤。当然,这些只是其次,最重要的是会影响移液量。

吸取时保持1-2秒

所以,关爱拇指,吸取液体时,保持1-2秒,给弹簧一个缓冲。当然,在加模板的时候,提高模板加样量,也可以尽可能减少每次加样的误差。

吸取液体的时候,需要把枪头插入凹液面底部,而不是插到凹液面的侧面。侧面比较容易产生气泡:

枪头要插入凹液面底部

当然,你会说,每次枪头都插很深(莫名其妙觉得是在开车),但是这样的话,就很容易在枪头上沾上液滴,在微量的模板加样时,很容易导致加样量的误差。

枪头避免带液滴


2.RNA的降解,也就是RNA完整性的问题

RNA的完整性,一般体现在电泳过程中18S和28S的亮度上,如果这两个条带的RNA亮度变低,甚至没有,就说明RNA的完整性应该会有损失。(但实际上现在没人去跑电泳)导致RNA完整性受损的原因有很多,比如:


包括镁离子,pH,温度,紫外线,福尔马林等等都会对你的RNA产生影响。所以,要处处小心。于是有人做了这样的实验,就是对于RNA的降解,有没有什么方法可以降低RNA降解对于qPCR的影响。


他们分别分析了3`端和5`端的扩增CT值,以及长片段和短片段的ΔCT,发现RNA的完整性缺失与3`端和5`端没多大关系,但是短片段会比长片段扩增效率更高。所以,qPCR引物设计的过程中,尽量把片段设计得短一点。


3.抑制物,这点相对难解决

在反转录过程中或者PCR过程中都可能有抑制物,这些抑制物,比如Na离子,EDTA,SDS,酚,血红素,腐植酸等等,都会对qPCR结果产生影响。具体体现在扩增曲线里会是这样:


实际上去除抑制剂也只能在抽提的过程中尽量洗脱掉抑制剂,别的操作过程中其实也没什么办法(加促进剂可能又会产生不稳定因素)。

好了,看看你的操作过程中是不是有这样或者那样的问题,看看你的扩增曲线是不是有比较奇怪的变化,然后,进行改进吧。

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