荧光定量PCR - 实验步骤 - 实验方法

本文以细胞样品为例详细介绍了荧光定量PCR实验所需材料、试剂、仪器以及完整的实验步骤方法，供大家学习交流。

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实验材料：细胞样品

实验试剂：RNA提取试剂盒、荧光定量PCR Mix、TRIZOL、dNTP、氯仿、逆转录酶MMLV、异丙醇、Taq酶、DEPC水、ddH₂O、TE、MgCl2、琼脂糖、溴化乙锭、MOPS、甲醛、乙酸钠、EDTA、EB、溴酚兰

实验仪器：离心管、离心机、风光光度计、电泳槽、凝胶板、Realtime PCR仪

实验步骤：

1.样品RNA的抽提

①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离每 1ml 的 TRIZOL 试剂裂解的祥品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后 ，15℃到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。 RNA 全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀：将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀。

其中的RNA,混匀后15℃到30℃孵育10分钟后，千4℃下12000rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗：移去上清液，每1ml TRIZ OL 试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇( 75%乙醇用 DEPCH₂O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟．

⑤RNA干燥：小心吸去大部分乙醇溶液 ，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀：溶解RNA时 ，先加入无RNA酶的水40µl用枪反复吹打几次，使其完全溶解 ，获得的 RNA 溶液保存于-80℃待用．

2.RNA质量检测

1）紫外吸收法测定

先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。

①浓度测定

A₂₆₀下读值为1表示40 ug RNA/ml。样品RNA浓度(mug/ml)计算公式为：A₂₆₀ x 稀释倍数 x 40 ug/ml。

具体计算如下：
RNA溶于40 ul DEPC水中，取5 ul，1:100稀释至495 ul的TE中，测得A₂₆₀ = 0.21
RNA 浓度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml 或 0.84 ug/ul
取5 ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 ul，剩余RNA总量为： 
35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug

②纯度检测

RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。

2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 

①制胶 
1g琼脂糖溶于72 ml水中，冷却至60℃，10 ml的10 x MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
10x MOPS电泳缓冲液 

4.梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR
①β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3 μl按10倍稀释（加水27 ul并充分混匀）为10¹⁰，依次稀释至10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴，以备用。
②反应体系如下：
标准品反应体系

7.实时定量PCR使用引物列表
引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。

8.电泳

各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。