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实验技术交流

Western Blot的样本制备

文字:[大][中][小] 手机页面二维码 2020/11/24     浏览次数:    
Western Blot 是一种用于检测蛋白质以及蛋白质翻译后修饰的常用方法,可以对简单或复杂生物样品中的目标蛋白质进行半定量或定量分析。其操作步骤包括:

1.从细胞、组织或体液中制备样品(蛋白质提取和蛋白质浓度测量)
2.十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶通过电泳按大小分离蛋白质
3.将分离的蛋白质固定在硝酸纤维素(NC)膜或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上
4.封闭膜上的非特异性蛋白
5.用特异性一抗探测靶蛋白
6.与标记的化学发光或荧光分子偶联的二抗共孵育
7.检测反映抗原/抗体结合的信号

8.使用软件对目标蛋白条带进行光密度分析


Western Blot是分子生物学和蛋白质组学中最常用的技术之一。但Western Blot是一个多步骤的操作流程,因此任何一个步骤发生错误,都会导致最终的结果发生变异,从而降低了该技术的可靠性和可重复性。有研究表明,Western Blot的一些关键步骤,例如样品制备方法、跑胶、转膜、抗体的选择以及定量所用的归一化方法,对于可再现的蛋白质印迹结果至关重要。


样本制备

Western blot步骤中的一个经常被忽视的方面是有效的样品制备。有效的蛋白质提取和纯化步骤对蛋白质印迹实验的结果和解释有重要影响。为了有效地提取蛋白质,应该选择一种合适的均质化方法,该方法可以通过细胞膜的破裂有效地释放细胞内的内容物。另外,应该选择最佳的裂解缓冲液以促进蛋白质的正确溶解并防止蛋白水解降解,从而获得大量的目标蛋白质。


样本制备的原则

1.尽可能采取简单方法,避免蛋白丢失;

2.尽可能将所有待分析的蛋白质样品全部溶解;
3.细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解,低温和蛋白酶抑制剂防止蛋白降解;
4.提取过程中避免蛋白产生聚集、沉淀和变性;
5.防止发生人为的蛋白质样品化学修饰(例如加入尿素不要超过37℃,防止氨甲酰化而修饰蛋白);
6.尽可能去除样品中的非蛋白杂质和干扰蛋白;
7.样品裂解液新鲜配置,并分装冻存于-80℃。勿反复冻融;
8.制备方法应具有标准化、重现性、可靠性和简便性。


蛋白样品的类型

可溶性蛋白:

• 培养细胞中可溶性蛋白,包括:细胞质中的可溶性蛋白、细胞周质蛋白、细胞器相关蛋白、分泌到培养基中的可溶性蛋白。
• 自然宿主细胞中可溶性蛋白,包括:微生物、植物和动物细胞中的可溶性蛋白。

不溶性蛋白:

• 含包涵体的不溶性蛋白

• 膜相关蛋白和难溶性蛋白(非重组蛋白)


蛋白样品的制备流程

◊ 组织、细胞或菌体的破碎和裂解
◊ 沉淀溶液中蛋白
◊ 清除杂质
◊ 蛋白浓缩、纯化


组织或细胞破碎和裂解

为了全面分析细胞内的蛋白,需要对组织或者细胞进行有效地破碎和裂解,其方法取决于蛋白样品的来源。同时,因细胞破碎时蛋白酶可能释放出来,从而导致蛋白降解,影响后续实验结果,因此需要加入蛋白酶抑制剂进行保护。


破碎裂解的方法

◊ 温和破碎裂解法(针对组分单一或者分析某一特定组分):
◊ 渗透裂解(血细胞、组织培养细胞):将细胞悬浮于渗透溶液中,细胞因肿胀而释放细胞内容物。
◊ 冻融裂解(细菌细胞、组织培养细胞):反复冻融裂解细胞,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起肿胀,使细胞结构破碎。
◊ 裂解液裂解(组织、培养细胞):含有去污剂的裂解液处理组织或细胞,使细胞膜破碎,细胞内容物释放出来。
◊ 酶裂解(植物、细菌、真菌细胞):利用酶裂解含有细胞壁的细胞。
◊ 剧烈破碎裂解法(难于破碎细胞:固体组织、坚硬细胞壁):
◊ 超声裂解(悬浮细胞):利用超声波产生的切应力来裂解细胞,超声时应在冰上间歇进行。
◊ 弗氏细胞压碎器裂解(含有细胞壁的细胞):细胞悬液置于高压下强力挤出小孔,压力突然降低以及剪切力的作用导致细胞爆裂破碎。
◊ 机械匀浆裂解(固体组织、细胞悬液):将组织剪成小块,利用匀浆器在加蛋白酶抑制剂的匀浆液中破碎组织或者细胞。
◊ 研磨法(固定组织、微生物):样品冻存在液氮中,利用研钵和研杵快速将样品研磨成粉状。
◊ 玻璃珠匀浆裂解(含有细胞壁的细胞):利用剧烈震荡的玻璃珠打碎细胞的细胞壁,从而释放细胞的内容物。


裂解液一般组成

◊ 缓冲液(Tris-HCl):提供pH环境,使蛋白保持稳定,增加溶解性。
◊ 去污剂(表面活性剂):破坏蛋白之间的疏水相互作用,以确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作用导致蛋白聚合。
◊ 蛋白酶抑制剂:抑制蛋白酶的活性,防止蛋白被水解。
◊ 磷酸酶抑制剂:抑制磷酸酶的活化,防止蛋白样本脱磷酸化。
◊ 还原剂:二硫键断裂和蛋白质变性
◊ 其它:NaCl,促进细胞膜破裂使蛋白溶解

常见裂解液成分一览表

常用裂解液 常见裂解液成分 浓度 作用
NP-40缓冲液, RIPA冲液,  Tris-Triton缓冲液, Tris-HCl缓冲液
Tris-HCL
50mM-100mM(pH 7.4-8.0)
溶液pH缓冲
NaCL 50mM-150mM
细胞膜破裂和蛋白质溶解
型去污剂:NP40, 辛基葡糖苷, Triton X-100, Tween
0.1-2% 非极性不溶蛋白的溶解
型去污剂:SDS, 脱氧胆酸钠, CTAB 0.1-1%;0.1-0.5%;0.01-0.5%
包被带负电荷的蛋白质,并根据其分子量促进凝胶分离;难容蛋白的膜溶解
两性离子去污剂:CHAPS(CB3-10,ASB-14)
2% 破坏蛋白质间的相互作用
尿素 5-8M 破坏非共价相互作用并导致蛋白质变性
EDTA 1-5mM 螯合金属离子,减少氧化损伤并抑制金属蛋白酶
EGTA
螯合金属离子
甘油 5-10% 稳定作用
DTT 1-10mM 二硫键断裂和蛋白质变性
2-疏基乙醇 1-10mM
二硫键断裂和蛋白质变性
TCEP 10-50mM 二硫键断裂,破坏二级和三级结构
Na3VO4 0.1-2mM 抑制酪氨酸和碱性磷酸酶
NaF 50mM 抑制丝氨酸/苏氨酸磷酸酶
蛋白酶抑制剂磷酸酶抑制剂,cocktail
预包装的片剂或液体形式
抑制蛋白水解,抑制磷酸酶的活化


蛋白酶抑制剂的种类

常用的蛋白酶抑制剂:
• 丝氨酸蛋白酶抑制剂:PMSF,AEBSF-HCl,Aprotinin(抑肽酶), Chymostatin,亮肽素(Leupeptin)。
• 天冬氨酸蛋白酶抑制剂:PMSF,碘乙酸、抑肽素(Pepstatin),云芝发酵物。
• 巯基蛋白酶抑制剂:PMSF,TLCK,TPCK,Antipain-HCl,N-乙基顺丁烯二酰亚胺。
• 金属蛋白酶抑制剂(金属离子螯合剂):EDTA,EGTA,塔罗肽。
(磷酸酶抑制剂:NaF、激活的原矾酸钠、焦磷酸钠、β-甘油磷酸钠。)

常见裂解液成份一览表

抑制剂 工作浓度 分子量 抑制蛋白酶种类 稳定性
AEBSF 1mM MW:239.5
不可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂,抑制胰蛋白酶,糜蛋白酶,纤溶酶,凝血酶及激肽释放酶。
可溶于水,其pH7 的水溶液在4oC 可保持稳定 1-2 个月,在pH>8 的情况下会发生缓慢水解
Aprotinins抑肽酶
2μg/ ml
MW:6512
可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂,可抑制纤溶酶,激肽释放酶,胰蛋白酶,糜蛋白酶,但不抑制凝血酶和Factor Xa。
非常稳定,当  pH>12.8 时失去活性,可溶于水(10mg/ml),-20oC 下可长期保存。
EDTA,4Na
10mM
MW:380.2
金属蛋白酶的可逆性螯合物,可能同时影响其他金属依赖性生物过程。
其水溶液很稳定,其贮存液(pH8.5 的 0.5M水溶液)在 4oC 可保存数月
Leupeptin, 半硫酸盐
亮抑酶肽(亮肽素)
100μM
MW:493.6
可逆的丝氨酸及半胱氨酸蛋白酶制剂,可抑制胰蛋白酶样蛋白酶及一些半胱氨酸蛋白酶如:Lys-C 内切蛋白酶,激肽释放酶,木瓜蛋白酶,凝血酶,Cathepsin B 及胰蛋白酶。
可逆的丝氨酸及半胱氨酸蛋白酶制剂,可抑制胰蛋白酶样蛋白酶及一些半胱氨酸蛋白酶如:Lys-C 内切蛋白酶,激肽释放酶,木瓜蛋白酶,凝血酶,Cathepsin B 及胰蛋白酶。
Pepstatin A
1μM
MW:685.9
可逆的天冬氨酸蛋白酶,可抑制胃蛋白酶, Cathepain B&L,血管紧张肽原酶(renin)。
以 1mg/ml  溶于甲醇,搅拌过夜可以1mg/ml 溶于乙醇,333mg/ml 溶于 6N 的
PMSF
1mM
MW:174.2
不可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂,可抑制羧肽酶 Y, 糜蛋白酶,Factor  Xa,木瓜蛋白酶,纤溶酶,蛋白酶K,枯草杆菌蛋白酶,凝血酶及胰蛋白酶。
有毒!请现配现用,并在样本处理过程中分批加入(勿一次性加入),在 pH7.5 时半衰期为一个小时,贮存液(200mM 的甲醇或乙醇溶液)在 4oC 可保存 9 个月以上
抑肽素 A


很多细菌来源的天冬氨酸蛋白酶,与蛋白酶有微弱的结合。
乙酸,4oC  下可保存一周。
Trypsin Inhibitor,
Soybean
与需抑制的蛋白酶等摩尔浓度
MW:20000
可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂,抑制 Factor Xa 及胰蛋白酶
在低 pH 值情况下分解,其贮存液在-20oC时相当稳定。
Amastatin
10μM
MW:474.6
可逆的丙氨酰-氨基肽酶抑制剂
其水溶液只可保存一天,其 1mM 的乙醇溶液在-20oC 可保存一个月
Antipain,2HCl
100μM
MW:677.6
可逆的丝氨酸和半胱氨酸的蛋白酶抑制剂,可抑制木瓜蛋白酶及胰蛋白酶.对纤溶酶也有一定抑制作用.与Leupeptin  相比,它对木瓜蛋白酶和胰蛋白酶有更强的特异性。
工作液稳定期仅为数小时,但其10mM 的水(或缓冲液)溶液贮存液在  4oC 可保存一周,在-20oC 可保存一个月,还可溶于甲醇或DMSO。
Chymostatin
100μM
MW:604.9
可逆的 半胱氨酸丝氨酸蛋白酶抑制剂,可抑制糜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶,包括lalpha-,beta-,gamma-及 delta-糜蛋白酶

TLCK
100μM
MW:369.3
不可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂,抑制胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶,包括菠萝蛋白酶,Arg-C 内切蛋白酶, 无花果蛋白酶,木瓜蛋白酶,纤溶酶,凝血酶及胰蛋白酶
pH>7.5 时非常不稳定,贮存液(10mM  的1mM HCl,pH3.0 的水或甲醇溶液)也应该现配现用
TPCK
10μM
MW:351.5
不可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂,抑制胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶,包括菠萝蛋白酶,糜蛋白酶,无花果蛋白酶及木瓜蛋白酶。
工作液稳定期为几个小时,贮存液(10mM 甲醇溶液)在  4oC 下可保持稳定几个月

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